脂質(zhì)體納米粒（LNP）的微流控制備方法及系統(tǒng)組成

1.什么是脂質(zhì)體

脂質(zhì)體納米粒（LNP）是一種利用脂質(zhì)形成的納米微粒。它具有類生物膜結(jié)構(gòu)，可包封水溶性和脂溶物，具有高度的靶向性、無毒性、無免疫原性，并適于生物體內(nèi)降解。脂質(zhì)體作為藥物載體，能夠有效保護被包裹藥物并實現(xiàn)可控釋緩釋藥物，從而顯著提高藥物治療指數(shù)并降低藥物的不良反應(yīng)。

脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)在降低藥物毒性、增加藥物在靶點聚集和提高藥物療效等方面發(fā)揮重要作用。目前已研究出膜上載有或不載靶識別分子的靶向脂質(zhì)體，其中包括抗腫瘤藥、抗寄生蟲藥、抗真菌藥、激素、多肽、酶類藥物以及用于疫苗、基因治療和免疫診斷的藥物。已有許多脂質(zhì)體藥物獲批并應(yīng)用于醫(yī)療實踐，其中脂質(zhì)納米粒是最常見的納米制劑之一。

脂質(zhì)納米粒是由多組分脂質(zhì)系統(tǒng)構(gòu)成的，通常包含磷脂、可電離脂質(zhì)、膽固醇和聚乙二醇化脂質(zhì)。脂質(zhì)納米粒能夠?qū)⒅委熕幬锓庋b并遞送到體內(nèi)特定位置，并在特定時間釋放其內(nèi)容物，因此為各種藥物提供了寶貴的特異性遞送渠道。在基因治療領(lǐng)域，使用脂質(zhì)納米粒包裹核酸，如mRNA、siRNA、pDNA等，稱為核酸脂質(zhì)納米粒。

2.采用微流控制備脂質(zhì)體納米粒的優(yōu)勢包括以下幾個方面：

縮短混合時間：微流控技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)高速混合，使得脂質(zhì)體納米粒的制備時間大幅縮短。

提高均一性：微流控技術(shù)能夠精確控制流體的流動，從而提高納米粒的均一性，減少粒徑分布的廣度。

單分散性高（PDI低于0.2）：微流控技術(shù)可以產(chǎn)生高度單分散的納米粒，PDI值低于0.2，有利于藥物的傳輸和吸收。

高通量和連續(xù)生產(chǎn)：微流控技術(shù)可以實現(xiàn)高通量和連續(xù)生產(chǎn)，大大提高了納米粒的制備效率和產(chǎn)量。

納米顆粒生產(chǎn)的集成和自動化：微流控技術(shù)可以實現(xiàn)納米粒的集成和自動化生產(chǎn)，減少人為操作的干預(yù)，提高生產(chǎn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

多種粒徑的單分散納米顆粒：通過精確的流速控制，微流控技術(shù)可以實現(xiàn)多種粒徑的單分散納米顆粒的制備，滿足不同應(yīng)用需求。

多次制備的重復(fù)性好：微流控技術(shù)具有很好的重復(fù)性，可以多次制備具有相同特性的脂質(zhì)體納米粒。

合成小體積（μL）和大體積（L）的脂質(zhì)體納米粒：微流控技術(shù)適用于合成小體積和大體積的脂質(zhì)體納米粒，滿足不同規(guī)模生產(chǎn)的需求。

3、影響脂質(zhì)體納米粒合成的因素

納米脂質(zhì)體合成受多種因素的影響。大部分納米脂質(zhì)體應(yīng)用于抗癌藥物、mRNA、siRNA等的包封。納米顆粒的大小決定了包封分子的數(shù)量，并且影響了脂質(zhì)體與細胞組織之間的相互作用和釋放動力學(xué)。即使微小的粒徑差異也會導(dǎo)致藥物遞送效率的顯著差異。此外，粒徑大小分布也會影響包封和釋放效率。因此，精確控制納米脂質(zhì)體顆粒的大小和具有較低的粒徑分布非常重要。通過微流控技術(shù)可以精確控制流體大小和兩相比例，從而精確控制粒徑的大小和分布。

合成脂質(zhì)體納米粒的一個關(guān)鍵步驟是實現(xiàn)有機相和水相的快速混合?；旌系男屎途鶆蛐栽胶茫@得的脂質(zhì)體納米粒的大小和分布就越精確。目前常用兩種類型的微流控芯片進行納米脂質(zhì)體的合成，一種是魚骨形芯片，另一種是流動聚焦型芯片。這兩種芯片能夠?qū)崿F(xiàn)有機相和水相的控制和快速混合，通過快速稀釋乙醇相可以獲得較小粒徑的LNP。

納米脂質(zhì)體顆粒的大小不僅取決于所使用的芯片類型，還受脂質(zhì)體溶液組成（如脂類類型、分子量大小、濃度等）和水溶液組成（如pH值、鹽濃度、表面活性劑）以及兩相流速比（FRR）和總流速（TFR）的影響。FRR（流速比）指的是水相流速和有機相流速的比值，它是制備LNP的重要參數(shù)。根據(jù)經(jīng)驗，較高的流速比會合成較小的納米脂質(zhì)體，尤其在使用流動聚焦芯片時，流速比的影響更加顯著。然而，在使用魚骨形芯片時，流速比的影響較小。

TFR（總流速）指的是水相和有機相的流速之和。當(dāng)使用流動聚焦芯片時，TFR的影響較小；而當(dāng)使用魚骨形芯片時，增加TFR會降低混合時間，從而使LNP顆粒變小。脂質(zhì)體中脂類的組成和濃度也是決定脂質(zhì)體顆粒大小的重要因素。一般情況下，較高的脂類濃度會合成較小的LNP。其他影響因素還包括pH值、溫度和緩沖液組成等。

4、脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)組成

脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)的組成包括流量控制系統(tǒng)和微流控芯片。流量控制系統(tǒng)由2通道的OB1壓力驅(qū)動的流量控制器、2個流量傳感器和2個儲液管組成。同時，還需要配備魚骨形微流控芯片和流動聚焦微流控芯片，并按照以下圖示將其連接起來。

該脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)的原理如下：連接到壓力源的壓力控制器提供穩(wěn)定的壓力數(shù)值，通過管線為密封的儲液管施加固定的壓力，從而穩(wěn)定地輸出儲液管中的液體。液體經(jīng)過流量傳感器測量流速并反饋給壓力控制器，以實現(xiàn)準確的流量控制。然后，流體穩(wěn)定而準確地輸送到微流控芯片中，該芯片的具體參數(shù)可以通過計算機上的軟件進行設(shè)定和控制。2通道的壓力控制器分別控制含脂質(zhì)的乙醇相和水相溶液，兩相溶液可以分別調(diào)節(jié)流速。經(jīng)過流量傳感器和阻尼器后，在微流控芯片中混合，從而合成納米脂質(zhì)體。通過調(diào)節(jié)乙醇相和水相的流速、流速比和總流速，可以獲得固定粒徑大小的納米脂質(zhì)體。

與注射泵相比，該系統(tǒng)中的壓力驅(qū)動控制器具有良好的壓力穩(wěn)定性、高精度流量控制、無脈動、短穩(wěn)定時間和快速響應(yīng)等優(yōu)點，是微流控系統(tǒng)中性能最佳的流量控制器，也是制備納米脂質(zhì)體顆粒的理想泵。

該微流控系統(tǒng)是專為研究者設(shè)計的脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)，即使是沒有微流控和納米脂質(zhì)體合成經(jīng)驗的研究者也可以輕松合成納米脂質(zhì)體。通過簡單直觀的操作指南，可以精確控制納米脂質(zhì)體合成的參數(shù)，并以100ul/min-30ml/min的流速連續(xù)合成脂質(zhì)體，可獲得60-250nm高分散性的納米顆粒。此系統(tǒng)可以根據(jù)客戶需求合成脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)體粒子以及其他類型的納米顆粒。

法國Elveflow采用微流控系統(tǒng)進行細胞培養(yǎng)的應(yīng)用案例有：

w 微流控芯片上的細胞相互作用研究

w 采用微流控系統(tǒng)進行研究細菌對壓力和環(huán)境變化的適應(yīng)性

w 采用微流控循環(huán)閥進行細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的再循環(huán)

w 動態(tài)細胞培中細胞培養(yǎng)的循環(huán)

w 如何在微流控芯片中進行動態(tài)細胞培養(yǎng)的細胞染色

w 微流控動態(tài)細胞培養(yǎng)中細胞培養(yǎng)基灌注

w 微流控動態(tài)細胞培養(yǎng)中自動化細胞接種

w 微流控心肌細胞培養(yǎng)模型

w 采用微流控細胞培養(yǎng)灌注系統(tǒng)進行快速細胞培養(yǎng)基的切換

w 用于微流控qPCR的熒光讀取

w 采用微流控系統(tǒng)進行循環(huán)腫瘤細胞的捕獲

w 微流控芯片上活細胞檢測

w 采用微流控壓力泵進行弱蛋白結(jié)合的定量

微流細胞培養(yǎng)中采用的法國Elveflow微流控系統(tǒng)OB1 多通道壓力泵的參數(shù)：

法國Elveflow微流控系統(tǒng)OB1 微流控壓力和流量控制器可以選擇1-4個通道或者更多通道，每個通道的壓力和真空范圍可選，5個可選的范圍為：0-200mbar, 0-2000mbar, 0-8000mbar, -900-1000mbar, -900mbar-6000mbar. 具有模塊化，可升級的特點，采用Elveflow ESI 軟件進行控制。

法國Elveflow微流控系統(tǒng)OB1 微流控壓力和流量控制器的性能參數(shù)：

w 壓力穩(wěn)定性0.005% FS

w 相應(yīng)時間9ms

w 壓力分辨率0.003%FS

w 穩(wěn)定時間低于35ms

法國Elveflow微流控系統(tǒng)OB1 微流控壓力和流量控制器可用于數(shù)字微流控，流動化學(xué)&聚合物合成，細胞培養(yǎng)中的細胞灌注，細胞培養(yǎng)液的順序注射，單液滴測序，RNA 測序，芯片實驗室，器官芯片等應(yīng)用。